Como é modulada a expressão génica pelas interações entre transcrição e processamento de RNA?

Um conceito cada vez mais relevante sugere que a coordenação entre a transcrição e o processamento de RNA permite o ajuste fino dos resultados da expressão génica. Ao longo dos anos, importantes avanços na compreensão dos eventos acoplados de expressão génica emergiram de novas tecnologias. Em colaboração com o laboratório Proudfoot na Universidade de Oxford, o nosso grupo foi pioneiro no desenvolvimento de metodologias para o isolamento e análise de RNAs recentemente transcritos associados à RNA polimerase II. Poucos laboratórios no mundo trabalham com RNA nascente, uma vez que corresponde a uma fração muito pequena do RNA celular total e apresenta, por isso, um desafio de purificação. Consequentemente, o nosso laboratório encontra-se numa posição única para elucidar a rede de interações envolvidas nas fases iniciais da expressão génica. A nossa análise prévia de RNAs nascentes intactos através de sequenciamento de leitura longa demonstrou que, embora muitos transcritos sejam imediatamente processados por splicing, uma fração significativa de pré-mRNAs nascentes permanecia sem splicing e não era clivada no local poliadenilação (PMID: 33735606). O que acontece a estes transcritos nascentes sem splicing e sem clivagem? Acabam por sofrer splicing, poliadenilação e exportação para o citoplasma, ou representam produtos sem saída destinados à degradação no núcleo? Por que razão alguns pré-mRNAs são rapidamente processados por splicing enquanto outros permanecem sem processamento? O splicing diferido é funcional? Pretendemos responder a estas questões rastreando no espaço e no tempo os pré-mRNAs recentemente sintetizados e as suas interações com a maquinaria de transcrição.

Como é que mutações que perturbam o splicing dos transcritos BRCA levam ao cancro hereditário?

O cancro da mama é o cancro mais comum nas mulheres, e até 10% das doentes com cancro da mama têm predisposição genética. A síndrome hereditária de cancro da mama e dos ovários (HBOC) é uma doença com um enorme impacto nas famílias afetadas, uma vez que os cancros se desenvolvem frequentemente em mulheres em idade fértil. Temos a ambição de contribuir para a prevenção da HBOC, possibilitando a compreensão de como as mutações germinativas que perturbam o splicing dos transcritos BRCA1 e BRCA2 interferem com a homeostasia celular favorecendo a oncogénese. Um amplo espetro de mutações deletérias em BRCA1 e BRCA2 foi identificado, a grande maioria das quais resulta em perda de função proteica. Estamos a focar-nos na mutação fundadora do BRCA2 (c.156_157insAlu), presente em aproximadamente 30% de todas as famílias portuguesas com HBOC, representando 55% de todos os portadores de mutações germinativas em BRCA2 em Portugal. A mutação consiste numa inserção Alu que leva à exclusão total em fase do exão 3. Embora se assuma geralmente que esta mutação conduz à expressão de uma proteína BRCA2 mais curta, desprovida dos aminoácidos codificados pelo exão 3, muito pouco é conhecido sobre as vias moleculares alteradas nas células portadoras desta mutação. Dado que a proteína BRCA2 é fundamental para a proteção das cadeias nascentes em forquilhas de replicação bloqueadas e para a reparação de roturas de cadeia dupla do DNA por recombinação homóloga, e que os estrogénios estimulam tanto a transcrição como a proliferação celular, colocamos a hipótese de que, em células estaminais/progenitoras epiteliais portadoras de mutações com perda de função no BRCA2, os estrogénios aumentarão o stress replicativo acoplado à transcrição, afetando o destino das células estaminais.

O conhecimento fundamental dos mecanismos de splicing pode ser traduzido em terapias melhoradas de modulação do splicing?

Terapias emergentes baseadas em RNA ou moléculas dirigidas ao RNA estão a ser rapidamente desenvolvidas. As terapias de RNA têm o potencial de melhorar a vida de muitas pessoas afetadas por doenças difíceis de tratar, atuando seletivamente em componentes celulares até agora considerados “indruggable”. Nomeadamente, o fármaco modificador de splicing Nusinersen teve um impacto transformador no tratamento de bebés com atrofia muscular espinhal (PMID: 30221755).

O nosso objetivo é aproveitar o potencial das terapias de RNA para doenças cardíacas. Com base em evidências recentes que sugerem que o splicing de RNA desempenha um papel importante na patogénese da cardiomiopatia hipertrófica familiar (CMH) — a doença cardíaca hereditária mais comum e uma das principais causas de morte cardíaca súbita —, estamos a investigar o impacto das mutações associadas à CMH no splicing de RNA, utilizando como sistema modelo cardiomiócitos diferenciados in vitro a partir de iPSCs derivados de doentes (iPSC-CMs). Estamos particularmente interessados em mutações localizadas em intrões, que podem interferir com o splicing mas são frequentemente desconsideradas no diagnóstico genético médico convencional (PMID: 28497172). O nosso laboratório gerou uma coleção de iPSCs com mutações que afetam o splicing de genes associados à CMH por mecanismos distintos. Utilizamos cardiomiócitos diferenciados a partir destas iPSCs como modelos celulares para desenvolver abordagens de correção do splicing. Nomeadamente, estamos a conceber oligonucleótidos antisense (ASOs) para inativar sítios de splicing crípticos criados pelas mutações, e estamos a colaborar com bioquímicos da Universidade de Copenhaga para explorar estratégias de entrega eficaz de ASOs nos cardiomiócitos. Adicionalmente, estamos a explorar a edição de RNA mediada por Cas13 para a correção do splicing em células mutantes. Colocamos ainda a hipótese de que, ao elucidar a organização espacial e temporal do splicing de RNA no núcleo, poderemos ser pioneiros no desenvolvimento de estratégias inovadoras para desenvolver terapias de modulação do splicing com impacto clínico.

The 4D organization of pre-mRNA splicing.

Cardiac Splicing as a Therapeutic Target.

Impact of the Portuguese BRCA2 founder mutation on transcription and tissue stem cell identity.

Sousa-Luís R., Carmo-Fonseca M. Tools and tactics for studying alternative splicing. Nat Rev Genet. 2026. doi: 10.1038/s41576-026-00952-4.

Gomes-Silva B, Furtado M, Ribeiro M, Martins S, Carvalho T, Ventura-Gomes A, Maatz H, Parakkat P, Crocini C, Gotthardt M, Savisaar R, Carmo-Fonseca M. Alternative splicing dynamics during human cardiac development in vivo and in vitro. Stem Cell Reports 2026; 21:102757.

Lima BA, Pais AC, Dupont J, Dias P, Custódio N, Sousa AB, Carmo-Fonseca M, Carvalho C. Genetic modulation of RNA splicing rescues BRCA2 function in mutant cells. Life Sci Alliance. 2024;8(3):e202402845.

Barbosa P, Savisaar R, Carmo-Fonseca M, Fonseca A. Computational prediction of human deep intronic variation. GigaScience. 2023;12:giad085.

Sousa-Luis R, Dujardin G, Zukher I, Kimura H, Carmo-Fonseca M, Proudfoot NJ, Nojima T. POINT Technology illuminates the processing of polymerase-associated intact nascent transcripts. Mol Cell. 2021;81(9):1935–1950.

Prudêncio P, Savisaar R, Rebelo K, Martinho RG, Carmo-Fonseca M. Transcription and splicing dynamics during early Drosophila development. RNA. 2021;28:1–23.

Nojima T, Rebelo K, Gomes T, Grosso AR, Proudfoot NJ, Carmo-Fonseca M. RNA Polymerase II phosphorylated on CTD Serine 5 interacts with the spliceosome during co-transcriptional splicing. Mol Cell. 2018;72(2):369–379.

Bernardes de Jesus B, Matinho SP, Barros S, Sousa-Franco A, Alves-Vale C, Carvalho T, Carmo-Fonseca M. Silencing of the lncRNA Zeb2-NAT facilitates reprogramming of aged fibroblasts and safeguards stem cell pluripotency. Nat Commun. 2018;9(1):94.

Vaz-Drago R, Custódio N, Carmo-Fonseca M. Deep intronic mutations and human disease. Hum Genet. 2017;136:1093–1111.

Nojima T, Gomes T, Grosso AR, Kimura H, Dye MJ, Dhir S, Carmo-Fonseca M, Proudfoot N. Mammalian NET-seq reveals genome-wide nascent transcription coupled to RNA processing. Cell. 2015;161(3):526–540.

A complete list of publications can be found here.

2023: Prémio Universidade de Lisboa

2010: Prémio Pessoa

2007: Gulbenkian Science Award (Fundação Calouste Gulbenkian, Portugal)

ORCID: https://orcid.org/0000-0002-3402-7143

Google Scholar: https://scholar.google.com/citations?user=KbjLqH0AAAAJ&hl=en